柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學、含碳量及烷基化處理。
?。?）顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實際上色譜柱上所標的粒徑是一個平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實際上有一個顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。一般來說，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。
?。?）孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結構均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結構不均勻，流動相線性速度不均勻，譜帶擴寬。平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時可能會有分子排阻效應，或產(chǎn)生吸附效應從而影響定量的回收率及準確度。
因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時應考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料?？左w積作為硅膠多孔性的參數(shù)，在分離分析較大分子化合物時可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。
?。?）化學鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機基團，采用極性較小的溶劑作流動相。亦可鍵合極性較小的有機基團，選用極性較大的溶劑作流動相。
C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應目前應用最為普遍。如以十八烷基三氯硅烷與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應生成烷基化學鍵合相，商品名為M-Bondapak-C18。
?。?）碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術是將填料加熱到碳氫鍵斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計算碳含量?？梢酝ㄟ^增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。
碳含量增加，柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關，也與硅膠的密度及填料的表面積有關，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨以碳含量來預測色譜行為是不夠的。
?。?）C18硅烷化試劑是一個大于2 nm大分子，因此會與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴重的立體位阻。其結果導致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾，從而可影響定量分析結果。
這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨立反應，以減少在硅膠表面的硅醇基。烷基化處理采用小分子(如三甲硅烷)的試劑，其空間位阻遠小于C18基團。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。據(jù)報道，通過某些極活躍的化學試劑及特殊的反應條件，最高的覆蓋量可達50%。
很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在高效液相色譜的反應中選擇合適的色譜柱。表面上看C18柱雖然化學官能團相同，而實際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別，從而產(chǎn)生不同的分離結果。
發(fā)布于: 2023-05-27